对scRNA-seq数据进行挖掘，首先要进行降维、聚类和细胞定义。然后基于以上结果，再开展亚群分析、细胞通讯、拟时序、差异分析等各种高级分析。在这个过程中，如何定义每一类细胞群是整个单细胞分析的基础，也是重中之重，但同时也是最耗时、最复杂的一步。
2022年水稻的一篇文章中，研究人员采用了多种方式进行了细胞类型注释，今天小编以这篇文章为例，为大家展示下不同的注释方法。
图1
样本类型
在水稻从营养发育到生殖发育的转变过程中，IM（花序分生组织）、BM（分支分生组织）和SM（小穗分生组织）的建立发生在很短的时间。因此，作者在发育早期的两个阶段：S1(< 2 mm)和S2(2–3 mm)采集了花序样本，各两个重复，并采集leaf（L）作为对照。
单细胞转录组学确定了水稻花序中离散的细胞类型
首先，作者通过基因表达的定量集合分析定义的每个簇中标记基因和富集基因表达之间的相关性，将所有的细胞分为四类。对小穗和分生组织 marker 基因（基于前期遗传学实验）进行的qusage分析，判断cluster 1，11是spikelet（小穗组织），cluster5，9，13是meristem（分生组织）。基于L或S1/S2样品的优势基因，判定cluster7、8、14、12、15为leaf（叶），cluster0、2-4、6、10为rachis（轴）（图2a）。
图2
Spikelet亚分群
Cluster1和11 (spikelet) 的二次亚聚类分析揭示了10个小穗亚簇，通过小穗标记基因的表达分布，cluster7、5、0、9、4分别确认了各自的细胞类型（图3a）。除此以外，cluster1、3和6的基因表达谱富集了“细胞周期”、“应激反应”和“非生物刺激反应”，因此，它们被归类为spikelet supporting cells (SSC），支持整个小穗发育（图3a）。cluster2和8具有相似的基因表达谱和GO注释，与被注释为meristem（分裂组织）的cluster7共享相似的拟时序发育轨迹，因此两者均被归类为spikelet identity cells (SICs）。
图3
Floret亚分群
为了具体研究小花发育，作者去除SSC亚群，并将剩余细胞重新聚集成10个小花细胞亚群（图4a）。其中：
Cluster0， 2，8，9通过已知的 marker 基因判断出细胞类型，分别被鉴定为lemma（外稃）、palea（内稃）、lodicule（浆片）和stamen（雄蕊）；
Cluster5 特异表达的基因DWT1，通过做基因突变实验，发现这个基因突变后影响花的发育，判断DWT1为干细胞基因，从而判断cluster5为花的干细胞；
Cluster1，6 特异富集 ROC 家族基因，通过搜索发现这群基因在拟南芥中是在干细胞外层的 le 细胞中特异表达，于是在水稻中进行实验，验证了这群基因也是在 le 细胞中表达；
Cluster4有一群特异表达基因，追寻这些基因在拟南芥中的功能，发现其抑制托叶的生长，判断cluster4细胞为抑制托叶生长的细胞；
编码组蛋白的基因在小花亚群cluster3和4中富集，Histone4也在SM和FM附近的细胞中积累（图4e），表明水稻花发育期间可能存在保守的苞片抑制，否则苞片的产生将与分生组织竞争。因此，小花亚簇3被分类为“边界”细胞，将SICs和外稃与隐蔽的苞片细胞分开（图4a）。
Cluster7通过做原位实验，发现其差异基因在托叶的位置上表达。
图4
Meristem细胞亚分群
对被注释为meristem的cluster5，9和13进行的亚群分析，将细胞分为了12个meristem亚群，根据marker的表达情况，该组织被分为BM、IM、SM三大亚群（图5a）
图5
以上，就是该文章所有涉及到细胞类型注释的部分。作者采用了多种方式，例如基于marker表达，基于富集分析，基于拟时序，基于湿实验等，希望这篇文章多样的细胞类型注释方式能给各位老师带来一定启发。