通过SpectraMax Paradigm微孔板检测平台和Tune技术可自动扫描荧光蛋白分子来确定其最佳波长

       Molecular Devices公司基于SpectraMax ®Paradigm® 多功能微孔板检测平台的基础上推出了一款使用滤光片作为其单色器，但又可随意调节其检测波长的Tune卡盒，这种最新的检测技术融合了滤光片的高灵敏度和波长扫描的高灵活性等特点。Tune检测卡盒克服了传统光栅型单色器的缺陷，可以方便研究人员在更广的波长范围内优化各种试验所需的最佳波长，且检测灵敏度也较光栅型系统提高了10倍以上。Tune卡盒激发光波长范围360nm至790nm，发射波长范围400nm至850nm，且可以做到1nm步进，它也是一种多功能检测卡盒，除具有荧光强度（FI）检测模式外，还具有时间分辨荧光（TRF）和化学发光（Lum）检测模式。

SpectraMax Paradigm 检测平台融合了全新Tune检测技术

 

       具有**的光谱优化向导功能可简化了工作流程，即针对不同荧光染料分子扫描后自动计算出信号与背景的比值，找出此荧光染料分子的最佳激发与发射波长。软件会自动生成扫描热图，给出根据不同扫描波长对计算后的信号与背景比值，方便用户选择最优波长来完成试验，当使用EGFP荧光染料分子进行波长的自动优化设置后，其检测灵敏度较使用传统固定波长的方法提高了80倍以上。

 

激发和发射光谱扫描

 

       单独针对两个绿色荧光蛋白的突变体进行激发和发射波长扫描，分别将重组野生型 GFP （Clontech） 和增强型GFP（EGFP，BioVision）都用TE缓冲液都稀释至 10μg/ml， PH调为8 。为测量GFP样品（50ul）光谱学特性将其加入黑色384孔板中，黑色微孔板中仅含有缓冲液的孔作为参比孔。

 

       单独进行激发和发射光谱扫描时，将测量时间（Integration Time）设置为140ms。当确定最佳激发波长进行扫描时，首先将发射波长设置为530nm，激发波长从360nm至500nm 且每隔2nm步进。当确定最佳发射波长进行扫描时，首先激发波长设置为440nm，发射波长从470nm至600nm且每隔2nm步进。图一中显示出当EGFP的发射峰在506nm（GFP）附近，即512nm(EGFP；图一)时，其激发峰从394nm红移至482nm。

 

GFP和EGFP采用Tune技术（图一）

 

       使用SpectraMax Paradigm微孔板检测平台和Tune技术在SoftMax Pro6软件光谱扫描模式下获得GFP和EGFP的光谱。我们从光谱中明显发现它们的激发峰的最大值发生移动，蓝色线代表GFP光谱，绿色线代表EGFP光谱，虚线代表激发光谱，实线代表发射光谱

光谱优化向导功能

       使用SoftMax Pro6软件中的光谱优化向导功能来确定GFP和EGFP的最优波长，用户可以选择激发和发射波长扫描范围，同时也可确定波长步进度。光谱优化向导能够同时扫描激发和发射波长，并计算每一对激发/发射波的信号与背景的比值，计算方法的公式为（信号-背景）/背景。结果以热图形式显示出一对激发/发射波长，十字图标中心的位置显示出了最高信号与背景比值，图二为GFP扫描结果。

优化激发与发射波长（图二）

       光谱优化向导的结果可以通过热图的形式显示出来，给出了GFP荧光染料分子的最佳激发和发射波长，显示GFP优化后其最佳激发波长405nm、发射波长510nm，EGFP的最佳激发波长465nm、发射波长515nm(未显示)

        通过表一的数据可以发现，使用波长优化向导功能后提高了GFP的各种突变体检测灵敏度。GFP激发波峰与发射波峰相距112nm，灵敏度的提高得益于波长优化后适度改变了激发和发射波峰，然而EGFP激发波峰与发射波峰仅相距30nm，通过光谱优化向导功能计算后可得出最佳波长可以使得检测灵敏度提高80倍，优化后激发和发射波峰相距50nm，降低了的激发光干扰。

表一：分别通过Tune卡盒优化波长或固定激发和发射波峰，比较两种方法针对GFP和EGFP两种染料分子的检测下线（LLDs）

 

结论

当用户面对全新未知的荧光染料分子进行波长优化时，如果通过Tune卡盒的光谱优化向导功能不仅可以自动优化出该染料分子的最佳激发和发射波长并可以减少50%的时间。激发波长范围360nm至790nm，发射波长范围400nm至850nm，SpectraMax Paradigm微孔板检测平台加上Tune卡盒后，能够检测绝大多数常用的荧光染料分子，并且检测灵敏度较传统光栅型系统高出10倍以上。如上述试验所示，当使用的荧光染料分子(如EGFP)的斯托克位移较窄时，通过Tune卡盒波长优化功能可大幅度提高试验检测的灵敏度（提高80倍）。 Tune 卡盒除具有荧光强度检测模式外，也提供了时间分辨荧光和化学发光的检测模式，增加了试验检测方法的多样性。