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质粒抽提常见问题和解决

作者:北京雅安达生物技术有限公司 2014-09-15T00:00 (访问量:4130)

1.没有提出质粒或者质粒收获量很低
  
  A菌种老化
  
  建议:对于甘油保存的菌种,需要先进行活化,涂布或者划线菌种,重新挑选单菌落进行液体培养,并对菌种进行初摇活化,按照1:500的比例进行菌种培养。二次培养时间最好不要超出16小时(或者OD600不超过3.0)。
  
  B低拷贝质粒
  
  建议:如果是由于低拷贝质粒引起的质粒收获量低,可以采用两倍的菌体量,并相应增加各种Buffer的用量。
  
  C质粒丢失
  
  建议:某些质粒在次继代培养的过程中会出现丢失的想象,另外检查筛选抗生素的浓度是否正确。
  
  D裂解不充分
  
  建议:如果采用超过推荐量的菌体进行质粒制备,会导致菌体裂解不充分。可适当减少菌体的用量或者相应增大各种Buffer的用量。并确保细菌混悬均匀。
  
  EBuffer中有沉淀未溶解
  
  建议:BufferB1和BufferN1,BufferC1在温度较低时会出现沉淀,使用前请检查是否有沉淀生成,如果有沉淀生成,请置于37℃温育片刻,待溶液澄清后使用。
  
  FDNAWashBuffer中未加入要求量的乙醇
  
  建议:按照说明书要求加入要求量的无水乙醇,使用后旋紧瓶盖,防止乙醇挥发。另外对于质粒中提,大提等,要求用70%乙醇洗涤,请确保乙醇的体积不小于70%。
  
  G离心柱中乙醇残留
  
  建议:漂洗后,可适当延长离心时间,尽量去除残留的乙醇。另外对于质粒中提,大提和朝大量提取,建议离心后,将柱子或大漏斗用吹风机冷风吹片刻(或置于65℃烘箱),以彻底去除残留的乙醇,便于洗脱和后续实验操作。
  
  H洗脱液加入位置不正确
  
  建议:洗脱液应加在膜中央,已取得最好的洗脱效果。
  
  I洗脱液pH值不正确
  
  建议:将DNA从柱子上洗脱下来的最适pH值在7.0-8.5之间,如果洗脱液的pH超出此范围将会显著影响洗脱效果,请使用试剂盒配套的ElutionBuffer(pH8.5,10mMTris-HCl)进行洗脱,如果用ddH2O进行洗脱,请确保pH在7.0-8.5之间。
  
  J洗脱体积的选择
  
  建议:洗脱体积将会影响最终的收获量,洗脱体积越大,收获量越高,但是浓度将会降低。请使用试剂盒推荐的洗脱体积进行洗脱,以保证最好的收获量和浓度。如果需要高浓度的质粒,请减少洗脱体积。另外,如果想收获高浓度高收获量的质粒,请根据试剂盒要求进行二次洗脱,再用推荐的方法进行沉淀,浓缩质粒。
  
  K洗脱时间的选择
  
  建议:加入洗脱Buffer后,室温放置2-5分钟,将有利于洗脱。
  
  2.质粒纯度不高
  
  A蛋白质污染
  
  建议:选择推荐量的菌体,离心后小心吸取上清,如果上清液中混有悬浮物,可再次离心,以彻底去除蛋白。另外如果用ddH2O作为稀释溶液,测定OD比值,比值可能较低,造成蛋白污染的假象,可用pH8.0的TEBuffer来稀释。
  
  BRNA污染
  
  建议:检查配送的RNaseA是否完全加入到BufferA1中,加入RNaseA后,BufferA1/RNaseA应该存放在4℃,如果存放时间过长,或者没有正确存放,RNaseA活力下降,请重新加入RNaseA。
  
  C基因组DNA污染
  
  建议:加入BufferB1后,轻轻颠倒混匀,避免剧烈震荡涡旋,加入BufferB1的处理时间最好不要超过5分钟。
  
  D菌株为含内源核酸酶的宿主菌株
  
  建议:请选用含内源核酸酶的宿主菌株质粒DNA提取试剂盒,或者转化质粒到不含内源核酸酶宿主菌株中。
  
  3.加样时DNA飘出加样孔外
  
  原因:柱中残留乙醇未除干净。
  
  建议:洗脱质粒DNA前确保无乙醇残留在柱子上。可再离心或者抽真空。

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