怎样提高ELISA的敏感性—ELISA放大系统

为了提高ELISA的敏感性,在ELISA中人们采用不同的放大机制,建立在ELISA的几类放大系统.现在向读者介绍几个比较重要的ELISA放大系统.

一,生物-亲和素系统(Biotin-Avidin System,简称BAS)

生物素与抗生物素之间具有极强的亲和力,可以缩短反应时间,达到快速检测的目的.另外,抗体和酶的生物素标记率高,又不影响其活性,每个亲和素分子能结合4个生物素,每个生物素能标记大量酶分子,使得ELISA的敏感性大大提高,生物素与亲和素的结合也极为稳定,不会在洗涤过程中脱落.BA-ELISA是在常规ELISA的基础上,结全生物素(Biotin)与亲和素(Avidin)的高度放大作用,形成的一种检测方法.BA-ELISA分为:

1,LAB法即酶联亲和素-生物素标记法(Labeled avidin-biotin,简称LAB).用辣根过氧化物酶直接标记亲和素,用生物素标记第二抗体.

2,ABC法即酶联亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法(Avidin-Biotin-Peroxidase Complex,简称ABC).如用链霉亲和素(Streptavidin),则形成链霉亲和素-酶联生物素复合物(Streptavidin-Biotin-Peroxidaes Complex,简称SABC).在ABC法中,用生物素标记第二抗体,又用生物素标记过氧化物酶.在使用前30min,亲和素与酶联生物素以1:1的比例混匀.1个亲和素分子结合3个生物素分子,亲和素剩下的1个结合点与标记第二抗体的生物素结合,亲和素起桥联作用.ABC法比PAP(Peroxidase-antiperoxidase tech-nique)法敏感几十倍.

3,BAB法即酶联亲和素-生物素桥法(Bridged avidin-biotin,简称BAB).用游离亲和素(或链霉亲和素)作为桥联剂,将生物素标记后开成的复合物与酶标记生物素连结起来,然后进行样品的检测.由于标记抗体分子上连有多个生物素,因此,最终形成的抗原-生物素标记抗体-亲和素-酶标生物素复合物可积聚大量的酶分子;加入相应底物后,产生强烈的酶促反应,大幅度提高检测的灵敏度.

二,碱性磷酸酶放大系统

碱性磷酸酶广大系统包含多种放大机制:碱性磷酸酶不直接催化底物生成有色产物而是催化生成辅酶I(NAD+),辅酶I激活下一轮氧化还原反应,辅酶I启动的反应为底物的颜色化学转变提供条件.在供氢体的作用下,底物氧化/还原发生颜色变化.

三,微粒放大系统

每个适当的微粒表面可以同时结合(或吸附)大量的标记酶和抗体分子.在包含微粒放大系统的夹心ELISA法中,微粒通过结合于其上的第二抗体结合于第一抗体.同时微粒上又结合着标记酶,其数量大大多于第二抗体能结合的标记酶,从而得以放大.

四,催化的显示剂沉积

催化的显示剂沉积(Catalyzed reporter deposition,简称CARD).CARD依次使用三套显示剂:第一套显示剂是联在抗体上的HRP,它通过抗体与待测抗原的反应结合于固相表面;第二套显示剂是标有生物素的苯酚,它受到第一显示剂的氧化催化后沉积于固相表面;第三套显示剂是标在链霉亲和素(Streptavidin)上的AP,可被固相上的生物素捕获,放大效果非常大.