口腔鳞状细胞癌（OSCC）是头颈部常见的癌症类型，每年有近70万新发病例和38万死亡病例。目前，基于病理诊断和肿瘤分期，OSCC主要采用手术、化疗、放疗联合治疗，其有效临床治疗仍然是一个挑战，尚需开发有效的新药。在不同的肿瘤中，苯乙双胍已被证明比二甲双胍具有更强的抗肿瘤活性，然而，苯乙双胍对OSCC细胞的影响尚不清楚。2024年5月8日，山东大学吴训伟/郭泾团队在“International Journal of Oral Science，IF 14.9”上发表论文Phenformin activates ER stress to promote autophagic cell death via NIBAN1 and DDIT4 in oral squamous cell carcinoma independent of AMPK。研究发现苯乙双胍诱导其新靶点DDIT4，特别是NIBAN1，促进细胞自噬和凋亡，从而抑制OSCC细胞的生长。本研究进一步支持了苯乙双胍的抗癌作用，为其在OSCC临床治疗中的发展提供了坚实的基础。
研究结果
1、在体内外实验中，苯乙双胍通过抑制OSCC细胞增殖、增强OSCC细胞凋亡和自噬来抑制OSCC的生长
研究发现苯乙双胍在体内外均能显著抑制OSCC细胞的生长，通过研究苯乙双胍对OSCC细胞增殖和死亡的影响，发现苯乙双胍治疗可以减少体外OSCC细胞的增殖，明显提高细胞凋亡率；Western blot分析凋亡细胞中激活的caspase通路，进一步验证了苯乙双胍诱导细胞凋亡的作用。qRT-PCR分析发现苯乙双胍处理OSCC细胞中p62、ATG7、Beclin-1、ATG12和Lamp-1 mRNA水平显著升高。此外，OSCC细胞转染GFP标记的LC3，然后用苯乙双胍处理，GFP细胞的点状染色显著增加，这些数据表明苯乙双胍可以促进OSCC自噬。进一步研究发现苯乙双胍通过诱导自噬体的形成来促进OSCC细胞自噬。
已有研究表明自噬可以诱导细胞凋亡，因此作者研究了苯乙双胍诱导的自噬是否可以促进细胞凋亡。自噬基因Beclin-1的敲低不仅可以阻断自噬的诱导，还可以降低苯乙双胍诱导的凋亡标志物的表达，提示苯乙双胍通过诱导自噬促进OSCC细胞凋亡。敲低Beclin-1可以恢复苯乙双胍诱导的OSCC生长抑制，提示苯乙双胍诱导自噬可促进体外OSCC细胞死亡。作者进一步在体内验证了这一结果，数据表明苯乙双胍不仅抑制OSCC细胞增殖，而且促进OSCC细胞凋亡和自噬，从而在体外和体内抑制OSCC细胞的生长。
图1.苯乙双胍在体外促进OSCC细胞的细胞自噬
2、苯乙双胍通过调控DDIT4和NIBAN1的表达诱导自噬的形成
为进一步了解苯乙双胍调节哪些信号通路来抑制OSCC细胞生长，作者对苯乙双胍处理的CAL 27 OSCC以及对照细胞进行了RNA-seq分析，发现自噬信号通路的激活是苯乙双胍对OSCC细胞的主要影响，RNA-seq分析发现了两个重要基因DDIT4和NIBAN1，苯乙双胍处理显著诱导其表达。接下来，为确定苯乙双胍是否通过高水平表达DDIT4和/或NIBAN1来促进自噬，进行DDIT4和/或NIBAN1敲低处理，发现敲低DDIT4显著抑制了苯乙双胍诱导的p62、Beclin - 1、ATG7和自噬标志物的表达，NIBAN1敲低以及DDIT4和NIBAN1双敲低后也获得了类似的结果，表明苯双胍通过调节DDIT4和NIBAN1的表达来促进自噬。据报道，DDIT4可负向调控mTOR通路，而NIBAN1可与mTOR通路相互作用，调控细胞凋亡和自噬。作者发现苯乙双胍抑制了OSCC细胞的mTOR通路，进一步实验发现苯乙双胍通过抑制mTOR信号通路诱导DDIT4和NIBAN1表达，促进细胞自噬。机制上，苯乙双胍通过正向调节ATF4而非ATF3来促进DDIT4和NIBAN1的表达诱导自噬，并且这种调节不依赖于AMPK的激活。
图2. 抑制DDIT4和NIBAN1表达可阻断苯乙双胍诱导的自噬
3、苯乙双胍直接诱导内质网应激，控制ATF4-DDIT4和NIBAN1的表达
接下来，作者证实了AMPK的敲低并不会抑制苯乙双胍处理诱导的ATF3或ATF4的表达。ATF4是一种应激反应基因，在体外，二甲双胍已被证明通过增加BIP、DDIT3和caspase-12的表达来激活内质网应激。因此，作者假设苯乙双胍通过激活内质网应激直接增加ATF4的表达。研究发现苯乙双胍可以诱导内质网应激激活PERK，而PERK的激活导致其下游靶点eIF2α的激活，从而增加了ATF4的翻译。进一步实验表明苯乙双胍诱导内质膜应激直接激活翻译机制，增加ATF4的表达，从而控制DDIT4和NIBAN1，促进自噬形成，导致细胞凋亡增加，最终抑制OSCC细胞生长。
图3.苯乙双胍通过调节内质网应激诱导ATF4、DDIT4和NIBAN1的表达
小结
综上，本研究确定了苯乙双胍的两个新靶点：DDIT4以及NIBAN1，并发现苯乙双胍不依赖AMPK的激活，而是诱导内质网应激进而激活PERK / eIF2α / ATF4轴通路，增强DDIT4和NIBAN1的表达，导致mTOR抑制，促进自噬，从而抑制OSCC细胞的生长。研究结果进一步支持了苯乙双胍的抗癌功能，并为将来开发苯乙双胍用于OSCC的临床治疗提供了坚实的基础。