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T4 DNA连接酶（快速）

产品描述
T4 DNA连接酶催化双螺旋DNA或RNA的5′磷酸末端基团和3′羟基末端基团之间形成磷酸二酯键。该酶能够有效的连接平末端和黏性末端，同时修复双螺旋DNA、RNA或DNA/RNA杂交链中的单链缺口。

蛋白来源
携带克隆的T4 DNA连接酶基因的重组大肠杆菌菌株。
组成成分：
10 mM Tris-HCl
50 mM KCl
1 mM DTT
0.1 mM EDTA
50% glycerol
pH 7.5 @ 25°C
随酶提供：
B1010 (2X Rapid Ligation Buffer)
B6030 (10X T4 DNA Ligase Buffer)
2X Rapid Ligation Buffer (B1010):
132mM Tris-HCI
20 mM MgCl2
2 mM DTT
2 mM ATP
15% PEG 6000
pH 7.6 @ 25°C
10X T4 DNA Ligase Buffer (B6030):
500mM Tris-HCI
100 mM MgCl2
50 mM DTT
10 mM ATP
pH 7.6 @ 25°C

单位定义
1 unit 被定义为23°C下、30分钟内，在50 µl 1X T4 DNA连接酶缓冲液中能够连接50%的具有粘性末端的100 ng DN**段的DNA连接酶量。

产品信息
T4 DNA Ligase (Rapid)
Part Number L6030-HC-F
Concentration 600,000 U/ml
Unit Size 26,000 U
SDS Available on request

产品特性
Storage Temperature -25 to -15°C
Test Specification
Purity (SDS-PAGE) >99%
Specific Activity 300,000 U/mg
SS Exonuclease 6,000 U <1.0% released
DS Exonuclease 6,000 U <1.0% released
DS Endonuclease 6,000 U = no conversion
E.coli DNA Contamination 6,000 U <10 copies

产品要点：
T4 DNA连接酶是ATP依赖的酶。建议舍弃在-20°C储存一年的反应缓冲液，用新鲜的缓冲液代替以确保最大性能。当把一个嵌入物当做目标靶物：矢量比在2到6之间时，单个嵌入的连接反应是最佳的。6:1以上的比率将会促进多重片段的嵌入，当下降到2:1比率时，将会降低连接效率。
对于有疑问的连接反应或如果DNA浓度是未知的，那就有必要将比率多样化并进行多重连接反应。
高浓度的PEG将会显著的降低电能细胞的转化效率。为了将电能细胞转化效率最大化，下面给出写推荐的方法：
最好的：在接下来的连接反应中，利用DNA净化吸附柱来净化产物，并用50uL的TE洗提。DNA即准备转化。DNA最终被转化的量应该在0.1-10 ng的范围之间。
较好的：在ddH20 或TE中稀释连接产物将会降低PEG浓度。DNA最终被转化的量应该在0.1-10 ng的范围之间。
高浓度的T4 DNA连接酶与2X快速连接缓冲液相结合能够显著提高平末端连接的速度和效率，因此不建议有较长的潜伏期（>10分钟），因为长的潜伏期能够显著的降低连接产物的转化效率。为了将正确嵌入或矢量结合的转化效率最大化，建议使用下面的方案。
酶的10X T4 DNA连接酶缓冲液不包含PEG，并与标准连接反应方案一致，该方案并没指定利用快速的缓冲区规格。

操作说明：
反应体系:
体积 组分 终浓度
10 µL 2X Rapid Ligation Buffer 1X
X µL Vector 1-10 ng/µL
X µL Insert 1-10 ng/µL
1 µL T4 DNA Ligase (600 U/ µL) 30 U/µL
X µL Type I Water N/A
20 µL 总体积
加入以上所有成分于反应管中，吹打混匀，25℃，10min孵育，立即使用PCR洗脱柱进行DNA的纯化，洗脱于50ulTE或双蒸水存储或者直接进行稀释（稀释比例至少1：10）并进行转化，将0.1-10ng 连接产物转入相应载体的电转或钙转的感受态细胞中。

参考文献
Engler, M.J. and Richardson, C.C. (1982) P.D. Boyer (Eds.), The Enzymes, 5, pp. 3. San Diego: Academic Press.

适用范围
该产品被研制、生产加工及销售，仅用于体外，不适用于人类和动物注射。

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