在细胞培养实验中，我们有时候会遇到很多问题。为抢救细胞，就得对症下药！
只要抓住这5点，救细胞就是小case~

一、样本本身
1.细胞衰老
2.个体差异（查看样本初始检测报告）
细胞自身问题
种子质量很重要
细胞在经过多次传代之后，细胞扩增能力就会下降，可以重新复苏更原始的细胞进行培养。
如果你使用的是冻存的细胞，那就有可能在冻存时该细胞的增殖能力就很弱了，可以通过查看以往的操作记录来判断。
还有一点就是个体差异，可以在培养前通过已知的标准对样本进行筛选，从而减少个体差异带来的影响。

二、外源污染
如果相同来源的其它批次的细胞并没有出现问题，你就要思考一下你是不是“中奖了”。请及时对可疑细胞以及培养使用的试剂进行隔离。
细胞污染原因及解决方法：

细菌污染
细菌是一种原核细胞微生物，其大小以微米(μm)计。
常见的污染细菌有革兰氏阴性菌和大肠杆菌、假单胞菌等，革兰氏阴性菌中白色葡萄球菌等比较常见。
一旦发生细菌污染较易发现，多数情况下培养液短期内颜色变黄，表明有大量酸性物质产生，出现明显混浊现象；有时静置的培养液液体初看不混浊，但稍加振荡，就有很多混浊物漂起。倒置显微镜下观察，可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮。必要时可取少量培养液涂片染色检查以证实细菌种类；有的培养液改变不明显而又疑有污染，可取出少量培养液用普通肉汤接种或用未加双抗药物的培养液接种，也可取10ml细胞悬液以100rpm离心5min，沉淀中加入无抗生素的培养液2ml，置于37℃培养，24h可得结果。
污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡，造成试验失败和细胞株(系)丢失。

解决方案：
(1) 丢弃所有已经污染的细胞和培养基；
(2) 培养环境用新洁尔灭擦拭且UV灭菌24小时；
(3) 培养试剂中加入P/S双抗；
(4) 尽可能使用一次性耗材及成品培养基；

真菌污染
真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，尤其在梅雨季节进行细胞培养更易污染。
污染培养细胞的多为烟曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。
霉菌污染后多数在培养液中形成白色或浅黄色漂浮物。一般肉眼可见，较易被发现，短期内培养液多不混浊，倒置显微镜下可见于细胞之间纵横交错穿行的丝状、管状、及树枝状菌丝，并悬浮飘荡在培养液中。镜下看时，要将培养瓶用酒精棉球擦干净，以防止与瓶外尤其瓶底外面生长的菌丝相混淆。
真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。

解决方案：
(1) 丢弃所有已经污染的细胞和培养基；
(2) 培养环境用甲醛熏蒸；
(3) 培养试剂中加入两性霉素B；
(4) 尽可能保持细胞培养环境的干燥；
(5) 注意戴帽子和口罩；
(6) 尽可能使用一次性耗材及成品培养基；

支原体污染
约有1%可通过滤菌器。支原体无细胞壁形态呈高度多形性．可为圆形、丝状或梨形。
支原体污染细胞后．培养液可不发生混浊．多数情况下细胞病理变化轻微或不显著，细微变化也可由于传代、换液而缓解．因此易被忽视。但个别严重者，可致细胞增殖缓慢．甚至从培养器皿脱落。

解决方案：
(1) 丢弃所有已经污染的细胞和培养基；
(2) 使用支原体清除试剂擦拭培养箱及超净工作台；
(3) 培养试剂中加入支原体清除试剂；
(4) 注意戴帽子和口罩；
(5) 尽可能使用一次性耗材及成品培养基；

黑胶虫污染
黑胶虫可以穿透滤膜，也可以通过空气传播，低倍下为黑色点状，高倍下可看见黑色的小虫游来游去，培养液不浑浊，一般不会太影响，细胞还是可以用的。常常是细胞生长状态良好，且观测到的运动物无明显增多，且培养液颜色、透明度无明显变化，可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。数量不多的时候对细胞生长状态不会有明显影响，在细胞增殖旺盛之后会自然消失，除更换血清外无须特殊处理。

原虫污染
培养液可轻微浑浊，显微镜下那些细小的点状物数量非常多，轻微活动，细胞虽然可以生长但繁殖速度却明显减慢，而且细胞状态不好，边缘不清楚，细胞不透亮。他们与细胞可共生但会与细胞争夺营养。

病毒污染
组织细胞培养过程中，如果没有除去潜在的病毒，就会产生病毒污染。

交叉污染
共用试剂、耗材，同时操作不同的样本，都极易造成交叉污染。交叉污染之 | 王应该属于HeLa细胞了，世界上已有很多细胞都受其污染，致使许多实验宣告无效。

面对以上问题，我们技术员需要注意几个方面，设备的洁净度，试剂的选择与储存，耗材的选择，操作方法。

三、试剂
在细胞培养实验中，如果出现使用同批次试剂培养的细胞大部分都出现问题情况，就需要锁定是否是试剂的问题导致的。
首先我们应该先要检查试剂的规格、效价是否与之前一致，如果有改变则需根据情况修改加入的量；
然后我们要检查试剂的品牌是否与之前一致，如果有更换应验证该品牌是否能适用于这类细胞。
最后我们要检查试剂的有效期是否过期、存放位置是否有问题、是否反复冻融等，以免试剂已因此而失效。
总的来说，就是要选对试剂、买真试剂、验证好试剂、保存好试剂、正确使用试剂。

四、操作
严格按照SOP操作实验，避免不必要的感染。轻吹打；掌握消化时间；及时观察细胞培养情况，合理补换液；增殖缓慢时，控制好补液时间，添加血清，细胞生长因子。



五、耗材
选择合适的一次性使用耗材，避免重复使用，确保培养瓶，培养皿等耗材是否可贴壁培养，选择品牌耗材。
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